超臨界CO2萃取的優(yōu)化方法提取斜葉微藻中的類胡蘿卜素和脂溶性維生素
為豐富公司員工的知識(shí)體系，開拓視野，本司定期開展文獻(xiàn)匯報(bào)的交流培訓(xùn)會(huì)，以提高員工的知識(shí)水平和能力。第二期《愛保農(nóng)文獻(xiàn)匯報(bào)》于2022年9月9日上午在愛保農(nóng)研發(fā)中心會(huì)議室如期舉行。外貿(mào)部伍婉君分享了一篇來自羅馬大學(xué)化學(xué)系Cleofe Palocci研究團(tuán)隊(duì)于2019年發(fā)表在《Molecules》的文章，文章名為“Extraction of
Carotenoids and Fat-Soluble Vitamins from Tetradesmus Obliquus Microalgae: An
Optimized Approach by Using Supercritical CO2”。本次文獻(xiàn)匯報(bào)除技術(shù)部與品控部同事到場(chǎng)參加外，還以騰訊會(huì)議的線上方式讓公司所有部門的同事都可在線參加，供大家討論與學(xué)習(xí)。
此文章主要研究了超臨界流體萃取法（Supercritical Fluid Extraction, SFE）中壓力、溫度和極性助溶劑等參數(shù)對(duì)提取斜葉微藻中類胡蘿卜素和脂溶性維生素產(chǎn)量的影響。通過采用超臨界流體萃取法中最常用的超臨界CO2萃取法（Supercritical CO2 (SCCO2)
Extraction），分別把實(shí)驗(yàn)條件控制在壓力范圍為25～35 MPa，溫度范圍為40～60℃，并對(duì)應(yīng)添加5%甲醇（MeOH）或檸檬烯（Limonene）作為助溶劑，設(shè)置13個(gè)實(shí)驗(yàn)組。此外，還設(shè)置了基質(zhì)固相分散萃取法（Matrix Solid-Phase Dispersion , MSPD）實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)。把各實(shí)驗(yàn)組萃取所得的提取物用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Liquid Chromatograph
Mass Spectrometer, LC-MS）進(jìn)行分析，分別得到α -生育酚、葉綠醌、γ-生育酚、視黃醇、角黃素、番茄紅素和葉黃素的提取率(平均峰面積±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于低極性或中極性類胡蘿卜素和維生素而言，通過調(diào)節(jié)SFE的壓力、溫度和極性助溶劑等變量條件，可獲得與MSPD相當(dāng)或更高的的提取率。尤其在SFE中使用檸檬烯作為助溶劑，番茄紅素可獲得更高的萃取率。但對(duì)角黃素和葉黃素這類強(qiáng)極性化合物而言，使用MSPD獲得的提取率則顯著高于SFE。
在伍婉君精彩匯報(bào)后，現(xiàn)場(chǎng)評(píng)委對(duì)其進(jìn)行了點(diǎn)評(píng)，參會(huì)人員均積極參與討論，并提出自己的疑問。此問答環(huán)節(jié)讓大家對(duì)此文章的內(nèi)容有了更深刻的理解。
答疑解惑 Q&A
1、什么是超臨界流體？超臨界流體是一種什么樣的狀態(tài)？
答：對(duì)于分子量不太大的穩(wěn)定物質(zhì)會(huì)存在一個(gè)臨界點(diǎn)，其由臨界溫度、臨界壓力和臨界密度構(gòu)成，當(dāng)把處于氣液平衡的物質(zhì)升溫升壓時(shí)，熱膨脹引起液體密度減少，壓力升高使氣液兩相的界面消失，成為均相體系，即為臨界點(diǎn)。高于臨界溫度和臨界壓力的流體是超臨界流體，即處于氣液不分的狀態(tài)。超臨界流體對(duì)溫度和壓力的改變十分敏感，具有十分獨(dú)特的物理性質(zhì)，其黏度低、密度大，良好的流動(dòng)、傳質(zhì)、傳熱和溶解性能，很適合用于提取物質(zhì)。
2、超臨界CO2萃取法的原理是什么？
答：其原理是CO2在超臨界狀態(tài)下與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小的成分依次萃取出來。并通過控制壓力、溫度、助溶劑等條件得到最佳比例的混合成分，然后借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體，使被萃取物質(zhì)完全或基本析出，從而達(dá)到分離提純的目的。
3、為什么此實(shí)驗(yàn)會(huì)采用CO2作為超臨界流體萃取的萃取劑，而不用其他物質(zhì)呢？
答：因?yàn)椋?/span>1）CO2具有、安全、無毒、成本低、易獲取的特點(diǎn)；（2）CO2臨界值低，臨界條件容易達(dá)到；（3）CO2化學(xué)性質(zhì)不活潑，不易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。因此CO2是目前較常用的超臨界流體。
4、甲醇與檸檬烯都是助溶劑，它們之間有什么區(qū)別嗎？
答：甲醇和檸檬酸都是助溶劑，加入助溶劑能改變超臨界流體對(duì)溶質(zhì)的溶解能力，但不同的是對(duì)于不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，助溶劑對(duì)其溶解性能有不同的效果。如，番茄紅素是一種結(jié)構(gòu)與檸檬烯非常相似的物質(zhì)，加入檸檬醛能使超臨界CO2更好的溶解番茄紅素，從而也能提高超臨界流體對(duì)番茄紅素的提取率；而加入甲醇能有效提高超臨界流體對(duì)脂溶性維生素的溶解性。
5、超臨界流體萃?。?/strong>SFE）具有什么優(yōu)勢(shì)呢？
答：首先，超臨界流體基于他獨(dú)特的物理性質(zhì)，具有良好的溶解性，很適合用于提取物質(zhì)。其次，超臨界流體處于超臨界狀態(tài)，對(duì)溫度和壓力的改變十分敏感，我們可以通過改變溫度和壓力等控制條件，獲得較高的提取率。
6、什么是基質(zhì)固相分散萃?。?/strong>MSPD）？
答：基質(zhì)固相分散萃取是美國Barker教授在1989年提出并給予理論解釋的一種快速樣品處理技術(shù)。其原理是將涂漬C18等多種聚合物的材料與樣品一起研磨，得到半干狀態(tài)的混合物，并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑梯度沖洗柱子，將各種待測(cè)物洗脫下來，以達(dá)到分離提取的效果。
7、基質(zhì)分散固相萃取法（MSPD）中提及樣品需要與C18一起研磨，C18在這里是起到什么作用呢？
答：C18具有疏水性和吸附作用，被C18吸附的物質(zhì)可通過不同的溶劑把待測(cè)物洗脫下來，從而達(dá)到快速分離的目的。
8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，對(duì)于角黃素和葉黃素，為什么MSPD的提取率顯著高于SFE？
答：角黃素和葉黃素從分子結(jié)構(gòu)上看，都具有含有兩個(gè)羰基，屬于極性很強(qiáng)的化合物，這種強(qiáng)極性化學(xué)結(jié)構(gòu)使它們即使在高密度和助溶劑甲醇存在的情況下，也很難溶于超臨界CO2，因此MSPD的提取率顯著高于SFE。
9、番茄紅素的提取結(jié)果中，以檸檬醛為助溶劑得到的提取率為什么會(huì)高于以甲醇為助溶劑得到的提取率？
答：番茄紅素是一種結(jié)構(gòu)上與檸檬烯非常相似的非極性化合物，因此在檸檬醛作為助溶劑的條件下，能更好地提取樣品中番茄紅素。
10、此文章中所提及的實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和重現(xiàn)性如何？
答：文章中的試驗(yàn)結(jié)果部分描述較簡(jiǎn)短，所以并未明確地提及該實(shí)驗(yàn)是否設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各物質(zhì)的提取率是用平均峰面積±標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示的。說明這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是通過多結(jié)果的平均值得來的。估計(jì)有兩種可能：一種是在各條件下進(jìn)行多組平行實(shí)驗(yàn)得到的提取物，分別進(jìn)行LC-MS分析，得到多個(gè)的峰面積。此操作方式更能真正體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，但會(huì)導(dǎo)致組內(nèi)數(shù)據(jù)偏差較大。另一種就是在各條件下得到的提取物，進(jìn)行多次LC-MS分析，獲得多個(gè)峰面積。此操作方式體現(xiàn)的是LC-MS分析結(jié)果的重復(fù)性，對(duì)超臨界流體萃?。?/span>SFE）或基質(zhì)分散固相萃取法（MSPD）提取物質(zhì)這一結(jié)果的重復(fù)性沒有指導(dǎo)意義。
11、通過這篇文獻(xiàn)，你學(xué)到了什么？對(duì)你未來的工作有什么指導(dǎo)意見？
答：通過此次文獻(xiàn)匯報(bào)學(xué)習(xí)，了解到SFE優(yōu)化后的萃取條件，與傳統(tǒng)的固液萃取相比，能有效提高某些化合物的提取率。但該文章中，以檸檬烯為助溶劑的實(shí)驗(yàn)組僅設(shè)置了一個(gè)萃取條件（溫度40℃，氣壓為25Mpa），未能體現(xiàn)以檸檬烯為助溶劑時(shí)，不同萃取條件下對(duì)各物質(zhì)提取量的影響。如在實(shí)驗(yàn)中增加檸檬烯助溶劑的萃取條件梯度（如，溫度分別設(shè)置為40℃、50℃和60℃，氣壓分別設(shè)置為25Mpa、30 Mpa和35 Mpa），能更好地對(duì)比不同萃取條件下，甲醇和檸檬烯這兩種助溶劑對(duì)各物質(zhì)提取量的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更完整。同時(shí)，對(duì)低極性或中極性類胡蘿卜素和維生素而言，可通過調(diào)節(jié)SFE的極性條件，獲得與MSPD相當(dāng)或更高的的提取率。但對(duì)角黃素和葉黃素這類強(qiáng)極性化合物而言，使用MSPD獲得的提取率則顯著高于SFE。這對(duì)日后提取物質(zhì)提供了較好的思路，我們可以借鑒這兩種萃取方法的原理，根據(jù)所需提取物質(zhì)極性大小的不同而選擇相對(duì)更優(yōu)的提取方法。
文獻(xiàn)引用：
Laura Chronopoulou, Chiara Dal Bosco, Fabrizio Di Caprio, Letizia
Prosini, Alessandra Gentili, Francesca Pagnanelli, Cleofe Palocci. Extraction
of Carotenoids and Fat-Soluble Vitamins from Tetradesmus Obliquus Microalgae: An Optimized Approach by Using Supercritical CO2 [J]. Molecules, 2019, 24 ( 14 ) .
原文鏈接：
https://sci-hub.se/10.3390/molecules24142581
